自噬是一个涉及到细胞自身结构通过溶酶体机制，负责将受损的细胞器、错误折叠的蛋白及其他大分子物质等运送至溶酶体降解并再利用的进化保守过程。

一、细胞自噬的基本概念及特征

1、自噬的过程

细胞质中的线粒体等细胞器首先被称为“隔离膜”的囊泡所包被,这种“隔离膜”主要来自于内质网和高尔基体;囊泡逐渐闭合最终形成双层膜结构,即自噬体，其大小约为 500 nm左右，囊泡内常见的包含物有胞质成分和某些细胞器如线粒体、内吞体、过氧化物酶体等;自噬体的外膜与溶酶体融合形成降解自体吞噬泡；由溶酶体内的酶降解自体吞噬泡中的内容物和内膜。

2、自噬的分类

巨自噬（Macroautophagy）：饥饿等刺激诱导下，胞质内产生双层囊泡结构包裹细胞器或长寿命蛋白形成自噬体，与溶酶体融合最终被降解的过程。

微自噬（Microautophagy）：溶酶体或液泡内膜直接内陷将细胞内物质包裹并将其降解的过程。

分子伴侣介导的自噬（CMA）：具有特殊模体的胞质蛋白被分子伴侣识别后，与溶酶体膜上的特殊受体——溶酶体相关膜蛋白Lamp2A结合，进入溶酶体被降解的过程。

3、影响因素

其影响因素包括：如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等，均会造成细胞自噬产生。正常情况下，细胞自噬发生的概率很低，只有受到以上因素的影响时，自噬才会被激活，参与机体稳态调控。

二、细胞自噬信号通路

自噬的调控

依赖mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶点）途径的自噬

（1）PI3K-AKT-mTOR信号通路

（2）AMPK-TSC1/2-mTOR 信号通路

其它的信号通路

（1）3-甲基腺嘌呤（3-MA）通过抑制Class ⅢPI3K的活性抑制自噬。

（2）beclin1和UVRAG作为正调控子，抗凋亡因子bcl-2作为负调控子共同参与组成Class Ⅲ PI3复合物调控自噬。

（3）GTP结合的G蛋白亚基Gαi3抑制自噬；GDP结合的Gαi3蛋白活化自噬。

（4）死亡相关蛋白激酶（death-associated protein linase,DAPK）和DAPK相关蛋白激酶（DAPK-related protein kinase-1,DRP-1）诱导自噬。

三、细胞自噬的研究方法

1.自噬体的观察

直接法：直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化，由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。

① 初期，主要特征是成新月状，单层或多层膜

② 中期：双层或多层的液泡状结构即自噬体结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网

③ 后期：形成自噬溶酶体，单层膜，胞浆成分已降解

间接法：

①RFP-GFP-LC3双荧光标记

当自噬体与溶酶体未发生融合时，RFP荧光和GFP荧光都是存在的，当自噬体与溶酶体发生融合时，导致GFP淬灭，此时只能观察到红色荧光

②GFP-LC3单荧光标记

利用了LC3在自噬形成时聚集的原理,即无自噬时,GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中

③MDC染色

MDC是一种嗜酸性的荧光色素，由于能使所有的酸性泡着色，故为非特异性染色

2、自噬相关蛋白的研究

WB检测LC3II/I，p62，Beclin-1，ULK1蛋白的表达量

干货!

自噬有哪些通路及分子参与：

四、自噬相关研究

研究自噬不可避免需要用WB检测LC3很多同学被LC3-I和LC3-II绕晕，所以LC3是从何处来呢？

LC3-I通过Atg7和Atg3（分别对应E1和E2样酶）参与的泛素样反应，使磷脂酰乙醇胺（PtdEth,PE)偶联，生成脂质化形式的LC3，也称作LC3-II，它可以附着自噬体（autophagosome)的膜上，是自噬体的结构蛋白。在降解过程中，位于自噬溶酶体外膜的LC3-II被半胱氨酸蛋白酶Atg4B移除后回收，位于内膜的LC3-II则与包裹的内容物一起，被溶酶体降解。

LC3A/B/C有种属细胞／组织分布特点

LC3/Atg8被具有蛋白内切酶活性的Atg4在羧基端剪切，生成胞质LC3-1,LC3-1通过Atg7和Atg3(分别对应E1和E2样酶）参与的泛素样反应，使磷脂酰乙醇胺（PtdEth,PE)偶联，生成脂质化形式的LC3,也称作LC3-l1,它可以附着到自噬体（autophagosome)的膜上，是自噬体的结构蛋白，在降解过程中，位于自噬溶酶体外膜的LC3-1I被半胱氨酸蛋白酶Atg4B移除后回收，位于内膜的LC3-l1则与包裹的内容物一起，被溶酶体降解。哺乳动物LC3蛋白的四个亚型（LC3A,LC3B,LC3B2和LC3C),他们的表达因组织或细胞类型而异。如图2所示，在甲状腺（Thyroid,第一行）中，LC3B的表达水平并不高，检测LC3A更为合适。所以需要根据自己使用的细胞系或者组织的情况，使用合适的靶标抗体。

当然通过使用抗LC3A/B抗体，同时检测LC3A和LC3B,可以大大增加实验的成功率。

敲黑板，如何跑好LC3-1和LC3-II?

LC3-1和LC3-II是小分子蛋白,LC3-I的分子量约16KD,由于LC3-II接合了PE基团，所以理论上，LC3-II的分子量比LC3-1更高。但是，由于带负电的PE改变了LC-II的性质，使其疏水性更强，导致其在电泳中迁移率更高，所以，LC3-II在电泳后，停留在了更小分子量（约14KD)处。小分子量、LC3-1与LC3-II仅有2KD差异，在WB中需注意：

·使用高浓度分离胶进行分离；

·转膜时，使用小孔径0. 22um转印膜，湿转70V 1.5h即可

2016年诺贝尔生理医学奖颁给了大隅良典后，表彰其自噬机制的发现。自此开启了研究自噬的大时代，另外自噬本身与肿瘤、免疫、神经退行性疾病成正相关，所以一直也是研究的热点。希望上述内容能给正在研究自噬的你一点点帮助。