2019-nCoV Nucleocapsid (omicron) Protein检测试剂盒

本试剂盒采用定量双抗夹心ELISA分析技术，将Nucleocapsid(omicron) Protein特异性抗体预先包被在酶标板上，之后将标准品和分析样本加入到微孔中，样本中Nucleocapsid(omicron) Protein会被预包被的抗体捕获，清洗掉未结合的物质后，将生物素标记的Nucleocapsid(omicron) Protein单克隆抗体加入到微孔中反应，形成夹心复合物，再加入HRP酶标记的链霉亲和素，清洗掉未结合的抗体及酶试剂之后，将显色底物溶液添加到微孔中显色，显色强度与样品中Nucleocapsid(omicron) Protein浓度成正比。

*在试剂盒保质期内使用

用于测定支气管肺泡灌洗液 、鼻咽拭子样本中Nucleocapsid(omicron) Protein的浓度。

所需设备及试剂

• 450 nm滤光片酶标仪，含540 nm或570nm校正波长更佳

•单道或多道微量移液器，移液器枪头

•去离子水

• 500 mL量筒

•样品稀释管或不同规格EP管

•吸水纸

试剂准备

使用前将所有试剂和样本置于室温平衡。

1. 20×浓缩清洗液： 如果浓缩液中有晶体析出，加热至室温并轻轻混合，直到晶体完全溶解，25mL浓缩清洗液使用去离子水定容至500mL，得到清洗工作液。

2. 标准品：用1mL样本稀释液溶解Nucleocapsid(omicron) Protein标准品冻干粉，溶解后标准品母液浓度为40ng/mL。震荡混匀后静置10分钟，再使用样本稀释液1:10稀释标准品母液得到第一个标准点4000pg/mL，依次进行倍比稀释操作得到共计7个标准点4000pg/mL、 2000pg/mL、1000pg /mL、500pg /mL、250pg /mL、125pg /mL、62.5pg /mL、最后再以100ul样本稀释液为零标准(0 ng/mL)，共计8个标准点，建议每个标准点至少做2个平行孔。

3. 检测溶液A(生物素标记)：震荡混匀后用掌上离心机瞬时离心，使液体集中于管底，临用前取合适体积用检测溶液稀释液1:1000稀释至工作浓度。

4. 检测溶液B(HRP标记)：震荡混匀后用掌上离心机瞬时离心，使液体集中于管底，临用前取合适体积用检测溶液稀释液1:2000稀释至工作浓度。

5. 显色液: 避光保存，显色时100μL /孔。

6. 终止液：显色完毕后50μL /孔。

使用前将所有试剂和样本置于室温，建议对所有标准品和样本进行一式两份的分析

1. 按照前面章节的指示准备所有试剂和准备工作。

2. 从板架上取下多余的微孔板条，将其放回装有干燥剂包的箔袋中，然后重新密封保存于-20℃。

3. 每孔加入100μL 稀释好的标准品(共计8点)和待测样本，用封板膜封住，37℃孵育60分钟。

4. 弃去孔内液体，每孔加入 300μL的清洗工作液，轻微震荡后弃去孔内液体，将酶标板倒扣在吸水纸上轻拍，使残留在孔内的液体全部去除，重复洗板3次，此过程也可采用尖嘴喷射瓶，多道移液器或自动洗板机来完成。

5. 每孔加入100μL检测溶液A工作液(生物素标记)，用新的封板膜封住，37℃孵育60分钟。

6. 重复步骤4中的洗板程序。

7. 每孔加入100μL检测溶液B工作液(HRP标记)，用新的封板膜封住，37℃孵育30分钟。

8. 重复步骤4中的洗板程序。

9. 每孔加入100μL显色液，室温避光显色10分钟。

10. 每孔加入50μL终止液，孔里的颜色应该由蓝色变至黄色，如果孔内颜色为绿色或颜色变化不均匀，轻轻震动酶标板板使颜色均一。

11. 擦干酶标板底部水气，立刻用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光密度值(O.D.值)，如果波长校正可用，则设置为540 nm或570 nm，如果波长校正不可用，则从450 nm的读数中减去540 nm或570 nm的读数，这种修正可去除酶标板读数中的光学偏差，如果没有校正波长，可直接读取450 nm的读数，但读值有可能会更高、更不准确。

标准曲线制作

取每个标准品和样本的复孔平均值O.D.，减去零标准孔平均值O.D.后，以标准品的浓度为横坐标，O.D.值为纵坐标，绘出标准曲线(R2值越趋近于1曲线越精确)，然后再将样本的平均值O.D.带入标准曲线的回归方程式，计算出样本中目标蛋白浓度。

如果样本已经稀释，从标准曲线上算出的浓度须乘以稀释系数，即为样本中目标蛋白的实际浓度。

标曲案例

标准曲线仅用于演示，每次实验均需生成单独的标准曲线。

检测范围

62.5pg/mL—4000pg/mL

最低检测限(MDD)

<50pg/mL

MDD是测试20个零标准(稀释液)的平均O.D.值上加两倍标准差后计算相应的浓度来确定的。

精密度

批内差： CV<12%

批间差： CV<15%

稳定性

试剂盒按推荐温度保存6个月，信号强度降低小于 10%。

实验细节说明

1. 在试剂盒标签上的有效期内使用，不要与其他厂家的试剂盒混合使用。

2. 如果样本检测值超出标准曲线范围，可适当调整稀释倍数并重新测定，或预估样本中蛋白浓度，在实验之前预先稀释数个梯度同时进行测定。

3. 为避免交叉污染，不同标准品、样本、试剂的加样需更换移液枪头，每管试剂使用单独的容器储存。

4. 在孵育过程中贴紧封板膜。

5. 显色液避光保存，临用前15分钟从冰箱取出在室温平衡。

6. 浓缩清洗液(20×)需使用去离子水1：20稀释至工作浓度，去离子水不包含在试剂盒中，需实验人员自备。

7. 终止液为酸性溶液，具有轻微腐蚀性，使用时避免接触皮肤、眼、耳、口等暴露部位，如不慎接触，使用大量清水冲洗后观察接触部位反应，如情节严重请及时就医。

8. 试剂盒酶标板条可按需拆卸使用，已开封的试剂盒建议在1个月内使用，未开封的试剂盒所有试剂均按试剂瓶标签上所示保存，收到试剂盒后请将标准品、检测溶液 A、检测溶液 B、以及预包板保存于-20℃，其余试剂请置于 4 ℃保存备用。

常见问题解决指南

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