TUNEL细胞凋亡试剂盒(Fluorescein-12)

1.实验前准备
（1）磷酸缓冲液PBS；
（2）溶于PBS的4%多聚甲醛固定液，pH7.4；
（3）溶于PBS的0.1% Triton X-100；
（4）如需染核，需备DAPI（2 μg/ml）或PI（1 μg/ml）；
（5）如需设置阳性对照组，需备DNase I Buffer及DNase I；
（6）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2.样品预处理
2.1 细胞样品
（1）细胞爬片或者涂片经PBS洗涤5分钟后，用溶于PBS的4%多聚甲醛液室温固定30分钟；
（2）PBS洗涤5分钟；
（3）用含0.1% Triton ® X-100的PBS溶液，37℃湿盒通透10-15分钟；
（4）PBS洗涤3次，每次5分钟；
注意：细胞涂片要做好方脱处理。
2.2 组织切片
2.2.1 石蜡切片
（1）室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中脱蜡10-20分钟，换用新鲜的二甲苯再脱蜡10-20分钟，重复1-2次；
（2）室温下用100%乙醇浸泡切片5分钟，重复2次；
（3）室温下用梯度乙醇（95%、80%、70%）各浸泡切片1次，每次5分钟；
（3）PBS浸泡、洗涤5分钟；
注意：在实验过程中，切勿让样品干燥，处理好的样本放在湿盒中保持湿润。
（4）配制Proteinase K工作液：按1:9体积比，用PBS作为稀释液，至终浓度为0.2 μg/μl；
（5）每个样本上滴加100 μl Proteinase K工作液覆盖样本，37℃湿盒通透15-20分钟；
注意：Proteinase K帮助组织和细胞进行染色剂的通透，孵育时间过长会导致组织或细胞从切片上脱落，过短则造成通透性处理不充分影响后续标记效率。为得到更好的结果，可以优化Proteinase K的孵育时间。
（6）PBS洗涤3次，每次5分钟；处理后样本放置在湿盒中保持样本湿润。
注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。
2.2.2 冰冻切片
（1）将玻片短暂回温后浸没在溶于PBS的4%多聚甲醛溶液中，室温孵育30分钟。
（2）玻片从固定液中取出后，置于通风橱中自然晾干；
（3）将玻片放入纯水或PBS浸泡、洗涤3-5分钟；
（4）每个样本上滴加100 μl Proteinase K工作液覆盖样本，37℃湿盒通透15-20分钟；
（5）PBS洗涤3次，每次5分钟；处理后样本放置在湿盒中保持样本湿润。
3. 阳性样本和阴性样本的处理（可选）
（1）阳性对照组：加入10 U/ml的DNase I；
（2）阴性对照组：加入等体积1× DNase I Buffer；
（3）所有分组均加入1×DNase I Buffer并完全覆盖样本表面，37℃湿盒孵育30分钟。
（4）去掉多余的液体并将玻片用去离子水彻底洗涤3-4次。
4. 染色标记
TUNEL检测液配置表：

注意：TUNEL检测液需现配现用，避免反复冻融。
（1）按1:9的比例，用ddH2O稀释10x Equilibration Buffer为1x Equilibration Buffer，备用；
（2）按照表格比例配置TUNEL检测液，每组切片滴加适量的TUNEL检测液使其完全覆盖（针对涂片、切片或者96孔板，48孔板、24孔板及12孔板，一般50μl TUNEL检测液可足够用于大小约为2.5*2.5cm的样本），注意不能干片且要避光；
（3）将玻片置于37℃湿盒避光孵育1-2h；注意孵育过程不要干片；
（4）立即用PBS溶液润洗3-4次，每次5分钟；
（5）在黑暗环境中将玻片浸入PI溶液（1μg/ml）的染色缸或DAPI溶液（2μg/ml），室温放置8分钟（可选）；
（6）用PBS清洗玻片3次，每次5分钟；
（7）用滤纸吸净玻片多余液体，用抗荧光猝灭封片剂封片。
注意：封片前可向样本区域加100μl含有抗荧光淬灭剂、20%甘油的PBS保持样本湿润。
5. 观察检测
荧光显微镜下观察，注意避光。PI/DAPI能将凋亡/未凋亡的细胞都染成红色/蓝色，只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-dUTP掺入而定位绿色荧光。
6. 流式细胞术检测悬浮细胞
（1）将3.0-5.0×10 6个细胞用PBS洗2次，每次4℃，1500rpm离心10分钟；
（2）用0.5 ml PBS重悬细胞；
（3）固定细胞：加入溶于PBS的4%多聚甲醛固定液1 ml，冰上放置30分钟；
（4）4℃，1500rpm离心5分钟，去上清；
（5）1 ml PBS重悬细胞，4℃，1500rpm离心5分钟，去上清并用0.5 ml PBS重悬；
（6）用1 ml含0.1% Triton ® X-100的PBS溶液通透细胞或用0.2μg/μl的protein k溶液工作液通透细胞，室温放置5分钟；
（7）1500rpm离心5分钟，弃上清，用1 ml PBS重悬细胞；
（8）转移细胞至一个新的1.5 ml微量离心管，1500rpm离心5分钟，去上清；
（9）用80 μl 1x Equilibration Buffer重悬，室温孵育30分钟；
（10）1500rpm离心10分钟，去上清；
（11）将细胞沉淀重悬在50 μl TUNEL检测液（参照TUNEL检测液配置表），37℃避光孵育1-2h，每隔15min用微量移液器轻轻重悬细胞；
（12）反应完成后加入1 ml 20mM EDTA终止反应，用微量移液器轻轻混匀；
（13）1500rpm离心10分钟，去上清并把细胞沉淀用0.5 ml PI溶液（1μg/ml）重悬，避光孵育30分钟；
（14）流式细胞仪分析细胞。 测量495-520nm波段Fluorescein-12-dUTP的绿色荧光和>620 nm波段PI的红色荧光。
7.常见问题及注意事项
（1） 荧光高背景
1.FITC被非特异性掺入，整个操作过程需保证样品的湿润；
2.高速分裂或增殖的细胞，有时也会出现细胞核DNA断裂；
3.TUNEL反应过强。可以用试剂盒提供的rTdT酶稀释液稀释rTdT酶2-5倍后再操作。稀释后的rTdT酶需当日使用完毕；
4.支原体污染。利用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染；
（2） 荧光信号弱
1.Triton X-100通透或者蛋白酶K作用不充分，可调整通透剂的浓度和孵育时间；
2.荧光淬灭，荧光剂需避光保存和使用；
3.由于凋亡细胞贴壁性减弱，因此在操作过程中应轻柔操作避免细胞丢失；
（3）出现非特异性标记
1.有些细胞和组织里的DNA酶活性比较高，易导致非特异性标记。解决办法是取完细胞或组织后立即对其进行充分固定，阻止酶活；
2.操作过程中可能混入DNA酶的污染。

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